降解行为调控技术包括-降解技术主要分类为
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1、rna转录后加工的四种方式?
原核生物的转录后加工:
mrna转录后加工:少数多顺反子mRNA需要由核酸内切酶切成较小的单位,再进行翻译,主要是有利于分别进行调控;少数噬菌体(如T4)中发现由内含子,需要拼接。
rRNA的转录后加工:E.coli.rRNA gene 与某些tRNA gene组成共转录单位(rrn operons),一共有7个这样的转录单位;共转录物经剪切、修剪和修饰后得到成熟的rRNA和tRNA。
tRNA的转录后加工:E.Coli中多数tRNA基因分散存在于基因组DNA中,少数于rRNA基因共转录;初级转录物两侧都有多余序列,需要经历转录后加工;加工方式包括剪切、修建和核苷酸修饰。
过程:核酸内切酶切去前体两端序列:RNase P产生成熟5#39;端;RNaseF切去3#39;端部分附加序列;核酸外切酶(RNaseD)从3#39;端逐个切去其余附加序列,产生成熟的3#39;端;核苷的修饰(碱基)。
RNase P,RNaseF,RNaseIII,RNaseE都是核酸内切酶,但是与DNA限制性内切酶不同,不是识别特定的核苷酸序列,而是识别特定的空间结构。
RNaseP是个特殊的酶:RNase和蛋白酶处理都可以使RNaseP失活;特定条件下,M1RNA可以单独切断tRNA的5#39;末端。
二、真核生物的转录后加工
1.真核生物转录后加工的特征
mRNA:转录和翻译再时间和空间上都被分开,所以转录加工十分重要;
tRNA,rRNA:需要转录后加工;
2.rRNA的转录后加工
rRNA基因是串联排列的中度重复序列;除5SrRNA外的其他rRNA作为一个转录单位转录;核仁是rRNA转录、加工并装配成核糖体的场所;主要过程与原核生物rRNA前体加工相似;依赖于RNaseIII和其它核酸内切酶;甲基化程度更高;需要snoRNA的帮助;有些生物的rRNA前体含有内含子,需要拼接;
哺乳动物的18S,28S,5.8SrRNA gene组成一个转录单位,有RNApolI转录产生45S的前体分子;5SrRNAgene与不同转录区域组成转录单位,由RNA pol III转录;
small nucleolar RNA(snoRNA):有几百种snoRNA,但只有少数参与rRNA前体加工;snoRNA与特定蛋白质组装成snoRNP后才能起作用;snoRNP中的RNA可以rRNA前提中的特定序列互补配对,以确定修饰位点;
3.tRNA的转录后加工:主要过程与原核生物tRNA前体加工相似,tRNAgene成簇排列,并被间隔区分开,由RNA pol III转录;需要多种核酸内切酶和外切酶;核内RNase P的RNA部分没有活性;细胞器中无RNase P;前体的3#39;端没有CCA序列;有些有内含子。因此加工方式包括:剪切、修剪、碱基修斯、添加CC、拼接;添加CCA和拼接是真核生物特有的两种后加工方式。
4.mRNA的转录后加工
真核生物中编码蛋白质的基因转录产物为单顺反子mRNA;mRNA的原初转录物是分子量极大的前体,在核内加工过程中形成分子大小不等的中间物,被称为核内不均一RNA(heterogeneous nuclear RNA,hnRNA);
加工过程(processing):5#39;端加帽(capping);3#39;端加尾(tailing);内部甲基化(internal methylation);拼接(splicing);编辑(editing)
4.1 5#39;端加帽:
绝大多数真核生物的细胞核mRNA和某些snRNA的5#39;端含有帽子结构;帽子有0型、1型、2型三种;酵母mRNA的帽子为0型;脊椎动物mRNA的帽子为2型;snRNA的帽子结构比较特殊;
加帽反应为共转录反应
一些snRNA带有其他类型的帽子结构:2,2,7-trimethylated guanosine
帽子结构的功能:保护mRNA,防止其被讲解;增强mRNA的可翻译性;促进成熟mRNA从细胞核转运到细胞质中;促进mRNA的拼接(有助于去除第一个内含子)。
mRNA加帽原因:只有RNA聚合酶II合成的转录产物(mRNA、部分snRNA)才有帽子结构;因为加帽酶只能与RNA聚合酶II的CTD结构域结合;而CTD是RNA聚合酶II特有的;加帽酶和CTD的磷酸化形式(延申型)结合;转录产物一旦从RNA聚合酶II中显露出来,就可以与加帽酶接触。
4.2 3#39;端加尾
真核生物的大多数mRNA及其前体在3#39;端有约250nt的连续AMP;poly(A)由poly(A) polymerase(PAP)添加;mRNA进入细胞质后,其poly(A)可以被更新;不断得被RNase降解,再由细胞质中的PAP重新合成。真核生物mRNA的3#39;端都有polyA,但组蛋白mRNA没有polyA;加尾过程在核内已经完成,核内hnRNA也有polyA。
polyadenylation signal(加尾信号)是一种顺式作用元件:真核生物(酵母除外)和病毒mRNA的3#39;端附近有一段保守序列AAUAAA(最常见,有效的加尾信号,AUUAAA大约有80%的有效性,其他变体既不常见,也不有效),称为加尾信号,删除后不能加尾;加尾信号在下游20nt左右进行多聚腺苷酸化。
其他顺式元件:动物细胞还包括:GU-rich motif和U-rich motif。植物细胞还需要U-rich motif;酵母细胞的加尾元件差别较大。
加尾所需的蛋白质因子(反式因子):剪切与多聚腺苷酸化特异性因子(CPSF);特异性结合AAUAAAsignal;剪切刺激因子(CstF):结合GUregion、与CPSF结合;剪切因子I和II(CFI、CFII):核酸内切酶;poly(A)聚合酶(PAP);PNA pol II;poly(A)结合蛋白(PABP);
加尾过程:第一阶段:CPSF识别 AAUAAA信号,招募 CF I、CF II、CstF、PAP等。CF I 和 II在下游 切断RNA,PAP添加约 10个AMP(慢反应);第二阶段:PABP与已形成的polyA结合, PABP、CstF使反应加速, PAP继续添加200个 以上的 AMP(快反应)。
尾巴的功能:保护mRNA防止降解;促进mRNA翻译;促进mRNA从细胞核转运到细胞质;提高mRNA的拼接效率(最后一个内含子的去除);产生终止密码子;通过选择性加尾调节基因表达。
mRNA加尾巴原因:跟加帽类似;
4.3 内部甲基化
主要是m6A;在hnRNA已经存在;功能不清楚;
4.4 拼接(splicing)
大多数真核生物基因是断裂基因
其中编码序列称为外显子(exon),外显子之间的介入序列称为内含子(intron);少数真核生物基因(如组蛋白、干扰素)是连续的;高等真核生物的基因中多数内含子比外显子长得多,而低等真核生物(如酵母)的基因中内含子比较短而且少见;含内含子最多基因:人巨肌蛋白(titin)基因,362个内含子。一些tRNA基因、rRNA基因也有内含子;tRNA基因的内含子较小(4-50bp);线粒体、叶绿体基因也有内含子。
RNA拼接定义:去除内含子,连接外显子称为成熟mRNA的过程称为RNA拼接。
I类内含子拼接:多数真核生物rRNA基因不含内含子;少数含内含子但不转录(如果蝇1/3rRNA基因含内含子但不转录);四膜虫(tetrahymena)的核rRNA基因、酵母线粒体rRNA基因含内含子,并转录;
四膜虫rRNA基因的拼接:需要G(GTP,GDP,GMP,G)不需要任何蛋白质的参与;称为自我拼接self-splicing或者自身催化auto-catalysis;分步很广,存在于低等真核生物rRNA基因、真核生物细胞器基因、细菌和噬菌体个别基因;I类内含子;内含子部分(L19 IVS)与传统酶有许多共性:提高反应速度、专一性等;但是反应前后自身发生变化,所以不是严格意义上的酶。但经实验证明他是酶。
核酶(ribozymes):具有催化活性的RNA;RNase P中的M1RNA;L19 IVS.
II 类内含子的拼接:酵母Cyt C氧化酶亚基a基因的拼接:内含子3#39;拼接点上有一个百分之百保守的A;也属于自我拼接;不需要鸟苷或鸟苷酸;存在于某些真菌线粒体和植物叶绿体基因。
I、II型内含子都能形成特征性的二级结构;都可以自我拼接;都可以作为转座子:I型内含子通过DNA介导的机制而移动,II型内含子通过RNA介导的机制而移动。I型编码核酸内切酶,II型编码逆转录酶。
真核生物核内pre-mRNA内含子的拼接:高度准确:依赖于多种顺式作用元件和反式作用因子;共转录事件(转录还没有结束时候就开始了);
顺式元件1:内含子具有一致的保守序列,即5#39;拼接点为GU,3#39;拼接点为AG,称为GU/GT-AG规则。
顺式元件2:3#39;拼接点上游的一段富含嘧啶的序列;约11个碱基组成;靠近3#39;拼接点。
顺式元件3:内含子序列内部有一个保守序列:分支点(branch point)。分支点保守序列决定下游的AG为3#39;拼接点。
反式因子:拼接反应在拼接体spliceosome中进行,酵母的拼接体约40s,哺乳动物的拼接体约60s;多种反式因子参与的复杂过程。
snRNP:small nuclear ribonucleoprotein particles;recognize the splicing signal
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